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Real-time PCR(Polymerase chain reaction)이란? 돌연변이 검사(Mutation test)
 
mRNA를 template로 하는 경우는 intron은 나오지 않겠지요. 그런데, intron은 exon에 비해서 대단히 크다. 따라서 exon 중에 몇 개를 한꺼번에 증폭하려면 DNA로는 힘들다.
더구나 intron sequence는 일부를 제외하고는 중요성이 떨어진다고 인식되어 밝히지 않은 것이 많아 GenBank에서도 찾을 수 없는 경우가 많다.
그것도 그렇지만 mRNA는 같은 genomic DNA에서 유래하였다고 해도 splicing 방법에 의해 변화 된 것도 찾을 수 있고, 각 조직마다의 expression 정도를 찾기에도 이용되며, 무엇보다 coding sequence만 연결된 구조를 원할 때 쓰인다.
PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소(DNA- dependent DNA polymerase)이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 없다. 따라서 RNA를 template로 할 경우는 일단 DNA로 복사한 다음 증폭합니다. 그래서 RNA를 PCR하는 방법을 RT-PCR (Reverase Transcriptase-Polymerase Chain eaction)이라고 한다. 이 경우는 PCR을 시행하기 이전에 RNA로부터 DNA를 합성해 주는 효소(RNA-dependent DNA polymerase)인 reverse transcriptase를 처리하면 된다.
Real-time PCR은 PCR 증폭 산물의 확인을 위한 전기 영동이 필요 없으며, 증폭이 지수함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 보다 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.
실제로, 유전자 발현, gene copy assay, genotyping, 등에서 시료에 있는 target gene에 대한 정확한 양 측정 에 이용되는 중요한 tool이라 할 수 있다. 통상 real time PCR은 형광시약을 사용한다. 형광을 monitor하는 방법에는 몇 가지가 있으며 아래 방법 중 선택할 수 있다.
Double strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR ® Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법이다. Interchelator는 PCR반응으로 합성된 double strand DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. 또한 증폭 DNA의 융해온도를 측정할 수 있다.
5’말단을 형광물질(FAM 등)로 3’말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 oligonucleotide (TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법이다. TaqManTM probe는 annealing step에서 주형 DNA에 특이적으로 hybridize하지만, probe상에 quencher에 의해 형광 발생이 억제된다.Extension 반응시에 Taq DNA polymerase가 갖는 5’→ 3’exonuclease 활성으로 주형에 hybridize한 TaqManTM probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발한다.
양 말단을 형광물질(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 oligo-nucleotide probe(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. Molecular Beacon probe는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하고 형광물질과 quencher 물질이 근접해 있어 형광발생이 억제된다. Probe는 annealing step에서 주형과 상보적인 영역에서 특이적으로 hybridize하고 이 때 형광물질과 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소되어 probe상의 형광색소가 형광을 나타낸다. 한편 hybridize하지 않은 Molecular Beacon probe는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않는다.

* 이외에도 molecular Beacon Probe 등도 사용이 가능
 
 
 
 
   
 
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